1. 生产工艺流程

本项目运营期主要进行基因治疗药物研发小试实验，主要工艺流程如下：

1. 分子克隆：采用DNA提取试剂盒提取HK293T细胞中DNA，得到DNA模板。外购引物使用PCR扩增仪扩增DNA模板，得到PCR产物。外购质粒，使用限制性内切酶进行切，用连接酶将质粒与PCR产物进行连接，得到连接产物。此过程中产生废试剂盒、废液、废包装材料。
2. 质粒转化：将连接产物转入感受态大肠杆菌NEB Stbl3溶液进行混合，混合物涂布于含卡那霉素、氨苄霉素的LB固体培养基（由氯化钠、琼脂粉、酵母粉、蛋白胨按照比例配制而成），筛选出转化的大肠杆菌，挑选单个菌体至含卡那霉素、氨苄霉素的LB液体培养基（由氯化钠、酵母粉、蛋白胨按照比例配制而成）进行培养。此过程中产生废包装瓶、废液、废实验耗材。
3. 质粒提取：将结合柱装入离心管，置于离心机中离心，将结合柱装入一新的EP管中，室温放置数分钟以确保乙醇挥发干净。在膜中央小心加入TE（由Tris-HCl与EDTA按照比例配制而成），不要戳破膜。室温放置2分钟，置于离心机中离心，离心管中即为抽提的去内毒素质粒DNA。
4. 琼脂糖凝胶制备：用纯水将制胶工具洗干净，准备好制胶平板，用琼脂将模具边缘封闭，架好梳子；根据要分离的样品（DNA）大小配制合适浓度的琼脂糖凝胶。
5. 种子培养：取含有目的质粒的大肠杆菌甘油管在超净工作台上接种至装有LB培养基（Tryptone 10g/L，Yeast Extract 5g/L，NaCl 10g/L）的试管或小三角瓶中，同时加卡那霉素母液，防止污染以及污染引起的形态或生理变化，在恒温摇床中培养以一定转速培养8~15h。此过程中产生废包装瓶、废液、废培养基。
6. 大摇培养：取培养好的种子按比例液添加到装有LB培养基的三角瓶中，同时加卡那霉素母液，防止污染以及污染引起的形态或生理变化，在恒温摇床中培养以一定转速培养15~17h。此过程中产生废包装瓶、废液、废培养基。
7. 离心收集：使用离心机进行离心，收集下层菌体，离心的上清液加入氢氧化钠灭菌，此过程中有废包装瓶、废离心管、废离心液。
8. 试剂盒法抽提质粒：利用试剂盒中的试剂对上述步骤中收集的菌体进行裂解和质粒抽提。根据菌体量和质粒用途选用不同规格或品牌的试剂盒进行抽提。此过程中产生挥发性有机废气、废液、废培养基、废试剂盒。
9. 琼脂糖电泳检测：与上述步骤一致，此过程产生废液、废实验耗材、废包装瓶、凝胶废气。
10. 细胞复苏：从液氮罐HEK293T工作细胞库取出一支冻存管，铺板HEK 293T细胞（含SV40片段，此片段可使细胞扩增），于37℃水浴锅中快速解冻，在生物安全柜中接种至含10%胎牛血清、谷氨酰胺替代物的DMEM培养基中，放置37℃、5%CO2培养箱中进行培养。该过程产生废弃耗材（冻存管、移液管、离心管等）和废培养基。
11. 细胞扩增：细胞复苏后，在含有10%胎牛血清谷氨酰胺替代物的DMEM培养基中，放置37℃、5%CO2培养箱中经过多次传代培养至一定的规模，扩增过程使用胰酶替代物消化细胞，使用PBS溶液清洗去掉胰酶替代物。该过程产生废弃耗材（移液管、离心管、培养瓶等）和培养废液。
12. 细胞转染：细胞扩增至一定规模后，转染试剂PEIpro和3质粒形成转染复合物导入HEK293T细胞中产生重组AAV病毒，此过程在P2实验室的生物安全柜中进行。该过程产生废弃耗材（移液管、离心管、枪头、注射器、滤器、储液瓶、培养瓶等）和培养废液。
13. 细胞裂解
14. 层析、纯化：通过亲和层析，使用层析缓冲液（由一水合柠檬酸、磷酸、盐酸、氢氧化钠、三羟甲基氨基甲烷按照比例配制而成）稀释AAV病毒，有亲和能力的AAV病毒附着在层析柱上，无亲和能力的大部分的杂质进入过柱废液，实现与AAV病毒的分离。
15. UF/DF过滤
16. 检测：加入蛋白酶K、SDS使病毒失活，进行QPCR检测、ELISA检测、WB检测、无菌检测、内毒素检测，检测病毒纯度、滴度。WB检测前使用BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）检测蛋白浓度，使用酶标仪读取数据。
17. QPCR检测：检测基因外显子区域大片段缺失或重复的一种技术。将DNA放入0.2ml八排单管，加入SuperReal，并盖上管盖，置于QPCR仪中检测荧光信号强度，从而判断模板起始拷贝数。主要使用试剂为dsDNA HS Assay Kits、HI-DI formamideBOTTLE、扩增试剂、SuperReal（荧光定量预混试剂增强版）等，此过程中产生废液、实验耗材。
18. SDS-PAGE凝胶检测：SDS-PAGE凝胶分为分离胶和浓缩胶，制作工序相同，使用的溶液浓度及体积略有不同，凝胶现制现用。加入SDS、TRIS盐酸（分离向细胞样品或者动物组织加入RIPA裂解液，使用超声波破碎仪破碎，离心吸取上清，即得到提取的蛋白，使用BCA试剂盒检测蛋白浓度。在加样孔中加入重组抗体蛋白，进行凝胶电泳。
19. 无菌检测：将样品分别取5ul接种于3管硫乙醇酸盐流体培养基和1管胰酪大豆胨液体培养基中。分别于30~35℃和20~25℃培养14天。如果培养基浑浊则结果可确定为阳性，如果清澈透明则为阴性。
20. 内毒素检测：核酸及蛋白提取步骤：采用RNA提取试剂盒提取细胞或动物组织中的mRNA；加入RIRA裂解液匀浆破碎细胞并离心，提取细胞或动物组织中的蛋白质。此过程会产生废弃耗材、废液和废弃的细胞及组织残渣。qPCR检测步骤：利用一步法试剂盒将提取的mRNA反转录成cDNA，以此做好对照，在冰上或者4度孵育20分钟，也可以在常温下孵育15分钟。加入流式染色缓冲液，1200转离心5分钟，去上清。重复一次再次洗涤去上清。加入流式染色缓冲液500uL重悬。如果是石蜡切片染色，则前处理为：65度烘片，二甲苯脱蜡，梯度无水乙醇水化，水洗，Tris-EDTAbuffer修复抗原，1xPBS洗涤。抗原修复后滴加免疫染色封闭液进行抗原封闭，加入一抗稀释液进行孵育，1xPBST浸洗，加入二抗稀释液进行孵育，1xPBST浸洗，加入DAPI染液进行染色，加入1xPBS清洗，滴加抗荧光淬灭封片剂盖上盖玻片。此过程会产生废弃耗材、各种试剂的清洗废液及挥发性气体二甲苯、乙醇、异味气体。

基因治疗药物研发工艺流程及产排污环节分析见图1-1、图1-2。

2. 生产设备

本项目主要研发设备见表2-1。