1. 生产工艺流程

1.1 施工期工艺流程

本项目位于某地区，施工期为基础工程、主体工程、安装工程和装修工程。施工期工艺流程图详见图1。

图1 施工期工艺流程及产污环节图

项目主要工程为基础工程（平整土地、地基开挖）、主体工程（建筑施工）、装饰工程（建筑装修、改造）、设备安装及工程验收等。土石方阶段、结构阶段和装修阶段会产生噪声；施工、运输车辆、材料装卸及地表开挖会产生扬尘；施工过程及施工人员会产生少量废水；施工建设会产生建筑垃圾和施工人员的生活垃圾。

1.2 动物笼具清洗及灭菌流程

动物笼具每周进行一次灭菌和清洗，先采用脉动真空压力蒸汽灭菌器和生物安全灭菌器进行高压蒸汽灭菌，完成灭菌后在洗消间内使用快速笼盒进行清洗。该过程会产生废垫料、废弃一次性实验用品、废包装物、笼具清洗废水、动物臭气。

灭菌原理是以饱和水蒸气作为灭菌介质，采用机械强制脉动真空的空气排出方式，经3-4次抽真空、注入蒸汽交替作用将内室空气强制排空，使空气排除量达到99%以上，彻底消除灭菌室内的冷点，完全排除温度“死角”，在高温和高压力的作用下使病原微生物蛋白质变性凝固、灭活从而达到灭菌的目的。

1.3 Shank3实验流程

Shank3实验流程图如下：

图2 Shank3实验流程图

（一）sgRNA设计与载体构建

1. 靶点选择：根据Shank3（如家犬Shank3外显子18-22区段）序列，利用生物信息学工具（如CRISPRscan、CHOPCHOP）设计特异性sgRNA靶点。优先选择外显子中高度保守且可能导致移码突变的区域。
2. 载体构建：CRISPR/Cas9质粒系统，将sgRNA与Cas9蛋白表达元件整合至pX330载体，通过T7E1酶切验证sgRNA活性。该步骤在湖北大学武昌校区国家重点实验室完成，不在本项目评价范围，本项目主要使用其CRISPR/Cas9混合液成品。

（二）胚胎显微注射与动物繁殖

1. 家犬模型制备：供体胚胎获取，对雌性家犬进行超排卵处理，采集成熟卵母细胞与精子体外受精，获得受精卵。显微注射，使用显微操作仪将CRISPR/Cas9混合液（含sgRNA、Cas9mRNA及单链DNA修复模板）注入受精卵原核。胚胎移植，将编辑后的胚胎移植至代孕母犬子宫，妊娠期约63天后分娩。
2. 小鼠模型制备：受精卵采集，对C57BL/6小鼠进行超排卵后取卵，与野生型雄性交配获取受精卵。电穿孔递送，采用CRISPR电穿孔技术将Cas9/sgRNA核糖核蛋白复合体（RNP）导入受精卵，减少脱靶效应。假孕母鼠移植，将胚胎移植至假孕母鼠，约21天后获得F0代嵌合体小鼠。

（三）验证与品系建立

1. 初筛与测序：将PCR产物送测序，通过比对野生型序列确认插入/缺失突变（Indel）。家犬需额外进行TA克隆测序以排除嵌合现象。
2. 蛋白表达验证：Western Blot，取动物前额叶皮层组织裂解液，使用Shank3特异性抗体检测蛋白表达水平，确认突变导致蛋白截短或缺失。
3. 稳定品系繁育：家犬，筛选杂合突变个体（F0）与野生型回交，获得F1代杂合子，再通过兄妹交配获得纯合突变体（F2）。小鼠，直接筛选F0代生殖系传递阳性个体，建立纯合子品系。

（四）表型分析与模型验证

1. 行为学评估：三箱社交实验，将Shank3体与野生型对照置于三箱装置，量化其对陌生小鼠/家犬的探索时间，评估社交互动缺陷。自我梳理与埋珠实验，记录30分钟内梳理次数或埋珠数量，检测重复刻板行为。
2. 神经电生理检测：离体脑片记录，取前额叶皮层或纹状体脑片，通过膜片钳技术检测突触传递长时程增强（LTP）变化，评估突触可塑性损伤。
3. 跨物种脑功能同步分析：人-犬脑电同步，利用EEG记录人类与Shank3家犬互动时的脑电信号，计算θ波（4-8Hz）相位同步指数，揭示社会认知神经耦合异常。

（五）安全性评估与伦理审查：脱靶效应检测，全基因组测序（WGS）分析潜在脱靶位点，筛选非预期突变。动物福利审查，实验方案需通过动物伦理委员会审批，确保符合《实验动物护理和使用指南》。

1.4 治疗实验流程

实验目的：递送修复Shank3或调控下游通路，探索自闭症治疗新策略。

1. 治疗载体构建：设计Shank3cDNA过表达AAV载体（血清型AAV9穿透血脑屏障）。
2. 颅内或全身给药：通过立体定位注射将载体递送至幼年家犬/小鼠脑区（如前额叶），或静脉注射利用PHP.B载体实现全身递送。
3. 疗效评估
1. 活体脑结构扫描：使用7T高场强MRI扫描仪，对麻醉家犬/小鼠进行T1/T2加权成像，分析皮层厚度、海马体积等结构变化。
2. 功能连接分析：静息态fMRI，检测默认网络、突显网络等功能连接强度，定位异常脑区（如扣带回、岛叶）。任务态fMRI，结合社交刺激（如同类面部图像），观察前额叶-杏仁核激活模式。
3. 多模态数据整合：将MRI数据与基因表达谱、行为学结果关联，构建“基因-脑环路-行为”多维模型。

1.5 实验结束后处理

项目使用蒸汽灭菌器和生物安全灭菌器进行灭菌工作，其灭菌原理是以饱和水蒸气作为灭菌介质，采用机械强制脉动真空的空气排出方式，经3-4次抽真空、注入蒸汽交替作用将内室空气强制排空，使空气排除量达到99%以上，彻底消除灭菌室内的冷点，完全排除温度“死角”，在高温和高压力的作用下使病原微生物蛋白质变性凝固、灭活从而达到灭菌的目的。

2. 生产设备

本项目完成后全厂主要生产设备详见下表。